以日本落叶松(Larix kaempferi)不同杂交组合为材料,依据转录组测序信息,成功获得了11种日本落叶松材料的4 CL基因的编码区序列,该序列长1 537 bp,包含完整ORF片段1 368 bp,编码455个氨基酸。qRT-PCR结果分析表明,除日本落叶松Larix16×Larix61组合外,Larix82×Larix13、Larix40×Larix10和Larix82×Larix61子代的表达均高于双亲,推测4 CL基因差异表达与落叶松杂种的木质素生物合成有关。进一步采用SNP标记方法和DNAMAN软件对不同日本落叶松杂种和亲本组合的单核苷酸多态性进行分析。共检测到66个SNP多态性位点,表明日本落叶松4CL 具有丰富的遗传多样性。66个SNP变异中,属于三突变1个;转换类型45个,占总变异的68.18%;20个属于颠换类型,占总变异的30.30%,转换:颠换=9:4。在转换类型中,A/G和C/T转换分别占28.79%和39.39%;颠换类型中A/C、A/T、G/C、G/T分别占4.55%、9.09%、9.09%和7.58%。采用NJ 聚类法对克隆片段的氨基酸序列进行了遗传多样性分析。

本文以改进CTAB法提取的总RNA为模板,通过设计茎环反转录引物,利用定量RT-PCR技术从黑杨幼嫩叶片、成熟叶片中均检测到miRNA。结果表明,miR159、miR167、miR171、miR319在三倍体幼叶中表达量均高于二倍体,miR164在三倍体成熟叶片中的表达量高于二倍体表达量。除miR319外,其余miRNA与其相应的靶基因在二倍体和三倍体黑杨不同阶段叶片中表达的消长关系都较为典型。暗示这些miRNA 靶基因可能与黑杨三倍体的速生性状形成相关。

本研究以黑杨中林46三倍体为材料,依据前期表达谱芯片的分析结果,分离克隆得到三倍体材料中高表达基因PtSIP3,该基因的编码产物为钙调磷酸酶B(Calcineurin B-like Proteins,简称CBL)的靶蛋白。随后构建了双元表达载体pRI101-PtSIP3,并成功的转入拟南芥中。经qRT-PCR表达分析和表型观察,发现PtSIP3 在拟南芥中异源过表达会抑制胚和果荚的发育、促进根的快速伸长。推测该基因在黑杨三倍体中的表达升高,可能会参与黑杨三倍体的营养生长期的调控并促进根的发育。

利用甲基化敏感扩增多态性技术,对二倍体与三倍体黑杨和白杨群体DNA甲基化进行了研究,共检测到745个基因位点,不同倍性杨树群体基因组DNA的总甲基化率为13.69% 18.84%,二倍体杨树平均为14.71%,三倍体杨树平均为17.72%。不同倍性杨树种群总甲基化率随着倍性的升高而升高,半甲基化率黑杨组也随着倍性的升高而升高,而白杨组正好相反;黑杨组全甲基化率没有明显的规律可循,而白杨组的全甲基化率则随着倍性的升高而升高。倍性与甲基化率的相关性验证分析结果表明:总甲基化率与倍性的相关系数为0.835,PPP>0.05,半甲基化率与倍性相关性较弱。不同倍性杨树群体的甲基化变异与序列变化具有显著相关性(r=0.910 3,P<0.01),推测甲基化变异具有种群特异性。

基于日本落叶松转录组测序(RNA-seq)结果,利用SSRIT工具查找SSR位点,检测到1 788个EST-SSR位点,平均长度是17.5 bp。进一步统计分析发现在落叶松中重复类型SSR位点出现次数最多的是六、三核苷酸,其余依次是五、二、四核苷酸重复类型;同时检测到656种重复基元类型,种类丰富。用Primer Premier 5.0设计500对引物,随机合成102对,以红豆杉科、柏科、松科材料为模板进行检测,结果显示在红豆杉科和柏科里的扩增率分别为95%、50%;在松科不同属的通用性为落叶松属99.01%、黄杉属67.4%、雪松属63.8%、冷杉属67.4%、云杉属70.2%和松属75.7%。利用101对SSR引物对7种不同落叶松品种亲缘关系进行了分析,获得79个多态性位点,在遗传相似系数0.69处将其区分为4个类群。

以日本落叶松杂交Solexa转录组测序获得的数据为依据,经拼接后获得尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶(UDPGDH)原序列,以该序列两端设计引物,在落叶松亲代和子代幼嫩针叶中成功克隆了UDPGDH基因cDNA序列,序列长1 443 bp,编码480个氨基酸。qRT-PCR结果分析表明:UDPGDH基因的表达量在落叶松杂交子代中远远高于亲本,正交子代的表达比反交子代高,说明UDPGDH在形成细胞壁半纤维素前体物过程中起着非常重要的作用,暗示UDPGDH在子代的高表达有利于杂种优势的形成。

利用同源序列克隆技术,分离了三倍体黑杨中4类(MET、CMT、DRM、DNMT2)8个特异甲基转移酶片段,其中,5个片段与二倍体同源性达到100%,3个片段发生了剪切变化。通过实时定量PCR技术检测8个甲基转移酶在不同倍性、不同部位、不同生长时期间表达模式的差异,通过对5个不同部位基因表达的检测,表明不同倍性黑杨在相同的部位可能由不同种类的甲基转移酶参与主要的甲基化调控。通过分析植株从分化早期的茎尖到分化晚期的叶和茎整个生长过程中基因表达的情况,发现随着时间的推移,MET家族 (PnD1和PnD2) 基因可能是拮抗调节,CMT (PnD3和PnD4) 家族基因可能是协同调节;而隶属于DNMT2家族的PnD6基因在各部位的表达都比较弱,唯独三倍体茎尖有很高的表达。由于茎尖是生长旺盛的部位,PnD6有可能是影响三倍体速生的重要基因。这些结果可能暗示,DNA甲基转移酶基因可能参与了黑杨发育过程中叶片形态发生的过程。

在植物进化及物种形成过程中,通过2个亲本的杂交可以使后代表现出速生、高产、高抗逆等优于亲本的性状,形成杂种优势;而通过同源或异源基因组加倍,也可使植物表现出明显优于亲本的生长发育性状或环境适应力,形成多倍体优势。因此,杂交及基因组多倍化被认为是推动植物进化和物种形成的2个主要驱动力。杂种优势及基因组多倍体优势已在农业生产实践中得到广泛应用,并产生巨大价值。基于此,探究植物杂交优势、基因组多倍体优势具有重大理论意义和应用价值,历来受到研究者的高度关注。目前,这方面的研究特别是有关杂种优势及基因组多倍化分子机制方面的研究已取得若干重大进展,本文旨在对这些研究成果进行概述,并对今后在木本植物中开展相关研究进行展望。